海藻糖的作用和效果,海藻糖的作用

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研究人员开发了合成的疫苗佐剂，该佐剂在其下限溶液温度（LCST）发生小幅（1-2℃）变化时，会减弱效力。佐剂添加剂可显著提高疫苗的效力。然而，佐剂也会引起炎症等副作用，限制了其广泛应用。近日，来自美国迈阿密大学的Rock J. Mancini教授团队进行了疏热海藻糖糖聚合物作为智能C型凝集素受体疫苗佐剂的相关研究。研究成果以“Thermophobic Trehalose Glycopolymers as Smart C-Type Lectin Receptor Vaccine Adjuvants”为题于2023年04月01日发表在《AHM》上。

图1 研究流程及机制图

为了解决以上问题，研究人员创造了一种疏热型疫苗佐剂，在与热射病相关温度下减弱效力。疏热佐剂由海藻糖糖脂疫苗佐剂与热敏性聚N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）通过可逆添加-破碎化链转移聚合而成。所得的疏热佐剂表现出接近37℃的LCST，自组装成具有随温度变化尺寸（90-270nm）的纳米颗粒。热疏性佐剂激活了HEK-mMINCLE和其他先天性免疫细胞系以及原始小鼠骨髓衍生树突状细胞和巨噬细胞。相对于平衡状态（37°C）或低于平衡状态，在模拟发热（高于LCST）的条件下，炎症细胞因子的产生有所减弱。这种疏热行为与DLS观察到的佐剂Rg降低有关，也与NOESY-NMR观察到的糖脂-NIPAM屏蔽相互作用有关。在体内，疏热佐剂通过提高中和抗体滴度淋巴结中心记忆T细胞，在病毒感染后提供更好的发病保护，增强了全灭活流感/加利福尼亚/2009病毒疫苗的功效。总之，以上结果证明由温度调节效力的佐剂是成功的。该方法可以在保持安全性的同时提高疫苗的功效。

图2 疏水性糖聚合物佐剂共聚物特性

在获得P1、P2和P3后，检查每种聚合物的LCST，结果显示虽然P1表现出广泛的LCST，但P2和P3在浓度为1毫克/毫升时，其LCST接近37℃，即聚合物浓度的降低使LCST值变宽并移向更高的温度（39-43℃），然后在较低的μg/mL范围内变得无法检测。通过DLS检查了作为温度函数平均颗粒大小的变化。所有3种聚合物都在100μg/mL时形成了纳米颗粒。温度的升高导致P1和P2形成的颗粒尺寸减小，而P3的趋势则相反。表明P1和P2纳米颗粒内的脂质链在水介质中形成二级结构方面起着重要作用。P2的分散性从37°C到39°C明显变宽，由于在LCST上占主导地位的疏水相互作用，加强了自结合。相反，不含脂质酯的P3表现出粒径增加，因为随着温度的升高会形成聚集体。通过GPC对聚合物进行表征，提供了多模式的峰值。NOESY-NMR还显示了P1和P2中的山萮酸酯亚甲基区域与每种聚合物的NIPAM亚基上的异丙基取代基之间的重要通空相互作用。

图3 Autodock Vina对接MINCLE晶体结构

在对P1-3进行物理化学表征后，接下来确定糖脂类聚合物作为体外佐剂的性能。由于已经建立的糖脂SAR，以及对接实验表明在Arg182和Phe19843之间保留了一个关键的桥接。首先假设脂质化的糖元1、P1和P2将各自激活巨噬细胞诱导的C型凝集素（MINCLE）受体。为了测试这一点，我们使用了HEK-mMINCLE细胞，该细胞将mMINCLE激活后的下游信号传递与碱性磷酸酶输出相联系，用量热法进行量化。结果表明糖脂多价性会极大地影响MINCLE的结合和随后的激活。在等摩尔的基础上，P1，特别是P2，相对于TDB阳性对照更有效。当佐剂在摩尔当量或佐剂亚单位的重量百分比方面进行平等比较时，只观察到P3的最小活性，表明NIPAM或海藻糖块都不是重要的MINCLE激动剂。在确认P1和P2是MINCLE激动剂后，接下来确定温度是否会影响炎症细胞因子的产生。首先通过将P1和P2与JAWSII免疫细胞孵化。结果显示TNF-α和IL-6在高温下炎症细胞因子的产生有所减弱，表明P1和P2是增热佐剂。

图4 原代小鼠免疫细胞中疏热糖聚合物佐剂的特征

阳性对照中细胞因子的功能性生产表明，在高温下细胞因子生产的减弱不是来自细胞死亡，在这个相同的温度范围内进行了活/死试验。为了更详细描述温度依赖性细胞因子的产生，在原始骨髓衍生树突状细胞（BMDCs）和巨噬细胞（BMDMs）中测试了P1和P2。与JAWSII细胞一样，用佐剂（100μg/mL）对培养物进行定量，并在35、37或39℃的温度下培养，有效穿越先前观察到的P2在此浓度下的LCST。此外相对于TDB，疏水佐剂（P1和P2）在温度升高时炎症细胞因子的产生（IL-6和TNF）有所下降，TDB没有强烈激活细胞，但在TNF方面确实表现出适度的温度依赖效应。细胞因子产生的减少归因于佐剂效力的减弱，因为阳性LPS控制显示每一种主要细胞类型。总之（1）佐剂的活性可能仅仅是因为随着温度的升高而发生的颗粒大小的减少，因为已知颗粒大小会影响糖脂的活性（2）活性可能由于脂质-NIPAM的屏蔽而减弱。

本文合成了NIPAM-海藻糖脂共聚物P1和P2，并对其热扩散特性和作为热疏性疫苗佐剂的性能进行了表征。与其他多价海藻糖脂一致，热疏散佐剂在HEK-mMINCLE和JAWSII先天免疫细胞系中表现出杂乱的激动作用，表明聚合物能激活MINCLE受体，并且也可以激活其他先天免疫细胞受体。P1和P2都显示出增热炎症免疫学特征，在体外的先天免疫细胞系（JAWS II）和初级骨髓衍生树突状细胞和巨噬细胞中，温度的小幅（1-2℃）变化对其进行调节。热敏免疫细胞激活的分子作用机制来自于聚合物构象的分子间或分子内的变化，粒径减小可能导致活性减弱，这可能来自于对活性至关重要脂质与NIPAM亚单位的疏水部分之间的屏蔽相互作用。通过变温DLS进一步结构阐释，发现P1的颗粒大小减少，P2的颗粒大小略有减少，表明脂质与聚合物骨架或异丙基侧链的相互作用在驱动疏热现象方面起着主要作用。在所有体外测试的细胞类型中，尽管P2的效力低于P1，但P2作为疫苗佐剂在体内的表现优于P1。P2的体内性能优于P1的原因可能是DLS表征中看到的粒径增大，或者是额外的NIPAM块带来增强。无论如何，这两种共聚物都比母体糖脂（TDB）诱发了较少的炎症。共聚物建立了第一个在体外随温度变化而调节其效力的疏水性佐剂，并且是体内有效的疫苗佐剂。在未来，疏热佐剂的概念将有助于解决疫苗佐剂在人群中引起的高度异质性的免疫反应，使佐剂活性与个体自身的免疫反应相适应。

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